箭叶淫羊藿具有祛风散寒、补肾固骨强筋的功效。然而，箭叶淫羊藿的不良反应已有文献报道，但其潜在机制尚不清楚。本研究旨在研究癌症研究所（ ICR）小鼠体内 箭叶淫羊藿 水提取物引起的肝损伤，并探讨其潜在机制。 通过将干燥的箭叶淫羊藿在水中煎煮以制备用于超高效液相色谱分析的水提取物。小鼠通过灌胃给予相当于 3g生箭叶淫羊藿/kg或10g生箭叶淫羊藿g/kg的水提取物，每天一次，持续三个月。 测定肝脏重量和血清生化参数水平，包括丙氨酸转氨酶（ ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、总胆红素（TBIL）和碱性磷酸酶。苏木精-伊红染色进行组织病理学检查 ； 使用TUNEL凋亡测定试剂盒检测细胞凋亡 ； ELISA试剂盒检测IL-1β ； 蛋白质组学用于鉴定差异表达的蛋白质 ；蛋白质印迹分析以确定显著受水提物影响的蛋白质水平。结果发现，箭叶淫羊藿处理组大鼠肝重和肝指数增加， ALT和AST水平非常明显升高（p0.05）。 高剂量能明显提高乳酸脱氢酶（ LDH）和 总胆红素（ TBIL ） 水平（p0.05) 。本研究还观察到细胞膜破裂和炎症细胞浸润，没有观察到细胞凋亡的迹象。 IL-1β水平非常明显升高（p0.05）。PIK3R1、p-MAP2K4、p-Jun N-末端激酶（JNK）/JNK、p-c-Jun、VDAC2、Bax和CYC的表达上调， 而 Bcl-2的表达则被抑制。 裂解的caspase -1的表达明显地增加； 但其对 GSDMD和GSDMD-N的影响明显降低。裂解的 caspase -3及其效应蛋白GSDME和GSDME-N的表达水平明显地增加。 研究根据结果得出，箭叶淫羊藿水提取物通过炎症性细胞焦亡 诱导 ICR小鼠 肝损伤。

　　箭叶淫羊藿水提取物的色谱图如图1所示；根据结果得出，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I、淫羊藿素和epimedokoreanin B的含量分别为1.28、3.58、2.98、0.16、0.22、10.67、0.22，0.45、0.33和0.23mg/g。

　　图1 箭叶淫羊藿水提取物的色谱图。1. 朝藿定A；2. 朝藿定B；3. 朝藿定B；4. 淫羊藿苷；5. 箭藿苷A；6. 淫羊藿次苷I；7. 箭藿苷B；8. 宝藿苷I；9. epimedokoreanin B；10. 淫羊藿素。

　　与对照组相比，高剂量箭叶淫羊藿处理的小鼠体重明显降低（p0.05）。与对照组相比，低剂量和高剂量箭叶淫羊藿给药组的肝脏重量和系数均明显地增加（p0.05）（表1）。

　　与对照组相比，低剂量和高剂量箭叶淫羊藿提取物处理的小鼠血清ALT和AST水平非常明显升高（p0.05，p0.01，p0.001）。高剂量箭叶淫羊藿处理的小鼠血清TBIL和LDH水平非常明显升高（p0.05）（表2）。

　　如图2所示，在对照组中，肝细胞显示出一个大的圆形细胞核，其核膜呈放射状排列在中央静脉周围。在用低剂量箭叶淫羊藿处理的小鼠肝细胞中，细胞结构正常，有细胞间隙，并观察到炎症细胞浸润。在高剂量组中，肝组织的正常结构被破坏。肝细胞排列不规则，细胞质稀少。我们还观察到炎症细胞浸润到多个部位（图2）。

　　图2 用箭叶淫羊藿提取物处理的小鼠肝组织的组织病理学变化。Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组。

　　TUNEL染色显示用80mg/kg补骨脂素处理14天的小鼠（细胞凋亡阳性对照组）的肝组织中存在阳性信号；然而，在箭叶淫羊藿处理组中未检测到明显的阳性信号（图3A）。

　　与对照组小鼠肝脏中相比，用箭叶淫羊藿处理的小鼠肝脏中IL-1β的表达水平明显地增加（p0.05）（图3B）。

　　图3 箭叶淫羊藿对细胞凋亡和炎性细胞因子IL-1β的影响。（A）肝组织TUNEL染色的代表性图像（40×）。Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组；PC，凋亡阳性对照。阳性对照是用80mg/kg补骨脂素处理14天的小鼠获得的肝组织。（B）箭叶淫羊藿能增强肝组织中IL-1β的表达。数据以平均值±标准误差表示。Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组。与对照组比较*p＜0.05。

　　由于高剂量的箭叶淫羊藿引起严重的肝损伤，分析了高剂量箭叶淫羊藿和对照组之间显著差异表达的蛋白质。对不同的生物过程进行了体内富集分析，包括代谢过程、对化学物质的反应和氧化还原过程。细胞成分最重要的包含细胞质、膜结合的细胞器、细胞内细胞器、内膜系统、细胞内膜结合细胞器和胞质溶胶。共有21个分子功能项，包括催化活性、离子结合、氧化还原酶活性和血红素结合（图4A）。如图4B所示，通过KEGG富集分析鉴定了36个信号通路。显著差异表达的蛋白质主要富集在代谢途径、蛋白质组、内质网中的蛋白质加工和胆固醇代谢中。此外，使用Cytoscape软件可视化富集的信号通路和显著差异表达的蛋白质之间的关系（图5A）。SRXN1、HERPUD1、PIGR、FADS2、PZP、PIK3R1、CYC、VDAC2、APOE、BDH1、VDAC3、EIF2B4、SQLE、RIPK1、TFR2、EIF3B、TRIP12、SLC4A4、DDX3X、KPNA2、PLAA、NOLC、FAH和TRIM28显示出潜在的肝毒性（表3）。此外，上述三种蛋白质，VDAC2、CYC和PIK3R1，被上调并与其他蛋白质相互作用，使用STRING计算出高的“综合得分”（图5B）。

　　图4 高剂量箭叶淫羊藿对显著差异表达蛋白质的富集分析。（A）显著差异表达蛋白质的GO分析。（B）显著差异表达蛋白质的KEGG分析的气泡图。

　　图5 网络分析。（A）富集信号通路及其相应蛋白质的网络。蓝色箭头表示信号通路。黄色节点代表显著差异表达的蛋白质，其大小由Cytoscape产生的反映其自身连接蛋白质数量的“Degree值”定义。节点越大，与其他蛋白质的连接就越多。（B）显著差异表达蛋白质的功能分类网络。亚组A：促进肝损伤的蛋白质；B亚组：应激反应蛋白或保护肝脏的蛋白；亚组C：参与基础代谢的蛋白质。绿色节点代表下调的蛋白质；粉红色的节点代表上调的蛋白质；灰色线表示蛋白质之间的相互作用。在亚组A的放大显示中，节点大小由倍数变化决定，边缘宽度由组合得分决定。

　　PIK3R1激活JNK信号通路。JNK被磷酸化的MAP2K4激活，随后可以激活c-Jun和其他蛋白质，如Bcl-2家族成员，从而调节炎症、存活和细胞死亡。图6显示，高剂量箭叶淫羊藿组的PIK3R1、p-MAP2K4、p-JNK和p-JNK/JNK的表达水平明显高于对照组（p0.05）。JNK信号通路下游的蛋白质p-c-Jun的表达也明显地增加（p0.05）（图6G）。

　　图6 E.箭叶淫羊藿上调参与JNK信号通路的蛋白质的表达。 （ A） PIK3R1、p-MAP2K4、pJNK、JNK和p-c-Jun的代表性蛋白质印迹扫描。 （ B）PIK3R1的定量。（C） pMAP2K4。 （ D）p-JNK的定量。 （E） JNK的量化。 （ F）pJNK/JNK的定量。（G）p-c-Jun的量化。 Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组。数据以平均值±标准误差表示。 与对照组比较 ， * p＜0.05。

　　VDAC2的表达水平在高剂量箭叶淫羊藿组中明显地增加（p0.05）（图7B）。如图7C、D和E所示，在高剂量箭叶淫羊藿组中，促凋亡蛋白Bax和CYC显著上调（p0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调（p0.05）。

　　图7 箭叶淫羊藿对细胞凋亡相关蛋白的影响。（A）VDAC2、Bax、Bcl-2和CYC的代表性蛋白质印迹扫描。（B）VDAC2的量化。（C）Bax的定量。（D）Bcl-2的定量。（E）CYC的量化。数据以平均值±标准误差表示。Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组。与对照组比较，*p0.05、**p0.01。

　　如图8B–F所示，与对照组相比，高剂量箭叶淫羊藿组NLRP3和裂解的caspase-1的表达水平明显地增加（p0.05），而GSDMD和GSDMD-N的表达水平明显降低（p0.05）。

　　结果显示，在高剂量箭叶淫羊藿组中，裂解的caspase-3、GSDME和GSDME-N的表达水平明显地增加（p0.01）（图8G–I）。

　　图8 箭叶淫羊藿对细胞凋亡相关蛋白的影响。（A）代表性的蛋白质印迹扫描。（B）NLRP3的量化。（C）caspase-1的定量。（D）裂解的caspase-1的定量。（E）GSDMD的量化。（F）GSDMD-N的定量。（G）裂解的caspase-3的定量。（H）GSDME的量化。（I）GSDME-N的量化。数据以平均值±标准误差表示。Cont，对照组；Low，低剂量箭叶淫羊藿水提取物组；High，高剂量箭叶淫羊藿水提取物组。与对照组比较，*p0.05、**p0.01。

　　以前的研究已经报道了淫羊藿及其相关制剂引起的肝损伤。然而，目前尚不清楚哪种淫羊藿能特异性地引起肝损伤及其潜在机制。箭叶淫羊藿属植物是淫羊藿属植物的起源种之一，在临床上存在广泛的应用。我们的初步研究表明箭叶淫羊藿对大鼠肝脏具有亚慢性毒性。然而，其根本机制仍不清楚。在本研究中，我们在 ICR小鼠 灌胃3个月箭叶淫羊藿后 引起肝损伤。 此外，蛋白质组学分析表明，显著差异表达的蛋白 PIK3R1、VDAC2和CYC是关键蛋白。JNK信号通路被激活， 细胞焦亡 参与了箭叶淫羊藿诱导的肝损伤。

　　器官系数反映了药物毒性，因为它在健康动物中相对来说比较稳定。然而，暴露于有毒物质，如二乙基亚硝胺，一种在小鼠和大鼠中用于建立肝细胞癌肝损伤模型的常用试剂，会明显地增加肝脏指数。在两个处理组中，肝脏重量和肝脏系数的显著增加与先前的报道一致。 AST和ALT是用于评估肝功能的经典标志物。 血清转氨酶水平高与肝细胞坏死和变性有关。暴露于箭叶淫羊藿三个月后， ALT和AST水平非常明显升高。 此外，肝功能的重要指标 LDH和TBIL在给予高剂量箭叶淫羊藿后也明显地增加，表明肝功能异常。ALT、AST、LDH和TBIL水平的变化与先前关于药物性肝损伤的报道一致。 组织病理学检查显示肝损伤的形态学证据。给予高剂量箭叶淫羊藿的小鼠肝细胞显示出具有多个炎症细胞浸润位点的不规则排列。 Gao等人还报道了淫羊藿诱导的特异性肝毒性中的肝细胞局灶性坏死和广泛的炎症细胞浸润。 这些根据结果得出，高剂量箭叶淫羊藿水提取物处理小鼠可诱导肝损伤。

　　药物诱导的肝损伤会导致肝细胞死亡。此前有报道称， 17批淫羊藿提取物诱导AML12正常小鼠肝细胞凋亡。 此外，在 LPS处理的雄性Sprague-Dawley大鼠中，灌胃给予朝鲜淫羊藿粉（0.22g/kg）6小时诱导肝细胞凋亡。 尽管在淫羊藿诱导的肝损伤中细胞凋亡已经有了很好的报道，但在本研究中没检验测试到强烈的细胞凋亡阳性信号。然而，淫羊藿的主要化合物淫羊藿次苷 II诱导了特殊的肝毒性，没有显著的细胞凋亡，但增强了炎症小体的激活，这在某种程度上预示着可能涉及其他机制。

　　由于高剂量的箭叶淫羊藿水提取物会导致小鼠严重的肝损伤，因此分析了高剂量组和对照组之间显著差异表达的蛋白质。蛋白质组学分析表明， PIK3R1、VDAC2和CYC在参与肝损伤的蛋白质中的 倍数 变化和综合评分值较高，可能是 箭叶淫羊藿 诱导肝毒性的关键特征。PIK3R1在胆汁淤积小鼠中增加，胆汁淤积小鼠的肝纤维化能够最终靠下调PIK3R1来减轻，表明PIK3R1对肝损伤至关重要。 此外， PIK3R1激活JNK信号通路； 活化的 JNK随后可以激活c-Jun和其他蛋白质，如Bcl-2家族成员，从而调节炎症、存活和细胞死亡。JNK磷酸化并导致Bcl-2的磷酸化或其从Bcl-2/Bax复合物中解离，从而诱导细胞凋亡或caspase介导的炎症反应。Bax的有效促凋亡功能依赖于VDAC2，VDAC2的缺失消除了Bax与线粒体复合物的结合。 在本研究中， PIK3R1、p-MAP2K4、p-JNK/JNK、p-c-Jun、VDAC2、Bax、CYC和裂解的 caspase -3被上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2被箭叶淫羊藿显著抑制， 这表明 JNK信号通路被箭叶淫羊藿激活（图9）。 先前的研究表明， JNK的激活最后导致细胞凋亡。 肝损伤过程中 JNK的磷酸化和 caspase -3的表达增加。 多组学研究还表明，肝损伤与细胞凋亡紧密关联。然而， TUNEL染色未能揭示箭叶淫羊藿给药小鼠肝组织中的明显凋亡，表明箭叶淫羊藿可能通过其他机制诱导肝损伤。

　　细胞凋亡和细胞焦亡 之间的串扰与肝细胞死亡有关。 尽管ccaspase -3被认为是一种凋亡促进剂，但在 caspase- 3存在的情况下，表达GSDME的细胞从凋亡转变为焦 亡 。Caspase-3不仅是诱导细胞凋亡的关键蛋白，而且还可以特异性地将GSDME切割为GSDME-N，后者穿透细胞膜以诱导焦 亡 。GSDME依赖性焦 亡 的激活增加了正常组织细胞的损伤和细胞毒性。 在这项研究中，在给予高剂量箭叶淫羊藿水提取物的小鼠的肝组织中，裂解的caspase -3、GSDME及其氨基末端GSDME-N的表达明显地增加，凋亡相关蛋白的表达也明显地增加。 研究表明，淫羊藿中的主要化合物淫羊藿次苷 I和 淫羊藿次苷 II可诱导NLRP3炎症小体活化并引起特异性肝毒性。 其他药物，如雷公藤内酯和牻牛儿酮，可诱导caspase 3-GSDME介导的焦 亡 ，导致肝损伤。 因此，我们推测箭叶淫羊藿的水提取物可能通过将细胞死亡机制从凋亡转变为焦亡来诱导肝损伤（图 9）。 然而，这一假设值得进一步研究。炎性细胞因子的激活和释放是细胞焦亡 的特征。Caspase-1可以切割IL-1β前体，使其成熟，并通过细胞膜上的孔释放。 在这项研究中，我们得知箭叶淫羊藿明显地增加了裂解的caspase -1和IL-1β的表达。IL-1β和其他炎性细胞因子放大组织中的炎症，并募集免疫细胞对感染或危险做出 响应 。 基于此，在肝组织中观察到的炎症细胞浸润可能是 IL-1β过度释放的结果。 我们的研究表明，炎症性细胞焦亡被触发 ，它会诱导箭叶淫羊藿 处理 小鼠的肝损伤。 然而，还需要针对ccaspase- 3/GSDME的进一步研究。

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